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實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2025年02月26日 14：10-15：26。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備及廠家：CELLImage Mini全自動(dòng)活細(xì)胞成像儀（聯(lián)慶瑞奇）、離心機(jī)（盧湘儀 ）、恒溫水浴鍋。

實(shí)驗(yàn)耗材及廠家：六孔板（中在）、凍存管（中在）。

實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM培養(yǎng)基（森貝伽）、胎牛血清（森貝伽）、青鏈霉素溶液（Biochannel）、胰蛋白酶（森貝伽）、DMSO（阿拉丁）。

細(xì)胞類型：A375細(xì)胞、 ZR751細(xì)胞、 HBE細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)方法步驟：

（1）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將完全培養(yǎng)液和胰蛋白酶從 4°C 中取出放置到水浴箱預(yù)熱 30 min 左右。同時(shí)，對(duì)生物安全柜進(jìn)行紫外照射消毒殺菌30min；

（2）觀察細(xì)胞：與此同時(shí)，將CELLImage Mini全自動(dòng)活細(xì)胞成像儀運(yùn)行的程序停止，并觀察此時(shí)細(xì)胞的狀態(tài)及密度，細(xì)胞融合度達(dá)到 70%-90%、細(xì)胞狀態(tài)良好即可進(jìn)行凍存；

A375細(xì)胞

ZR751細(xì)胞

HBE細(xì)胞

（3）洗滌細(xì)胞：在生物安全柜內(nèi)，將六孔板里的原有培養(yǎng)液全部移除，用 1×PBS洗滌細(xì)胞兩次，去除殘余的培養(yǎng)液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；

（4）消化細(xì)胞：每孔加入200ul胰酶溶液，能使其完全浸過(guò)細(xì)胞即可，37℃孵育 1-2 分鐘。在CELLImage Mini全自動(dòng)活細(xì)胞成像儀觀察，可看到大部分細(xì)胞變圓不貼壁，拍打培養(yǎng)瓶?jī)蓚?cè)會(huì)有大量細(xì)胞脫離，此時(shí)應(yīng)立即終止消化，若細(xì)胞仍然有大部分貼壁，可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間；

消化后A375細(xì)胞

消化后ZR751細(xì)胞

消化后HBE細(xì)胞

（5）終止消化：加入2ml完全培養(yǎng)液終止消化，吹打六孔板底 2-3 次使所有細(xì)胞徹底脫壁。將細(xì)胞懸浮液到 15 mL 離心管中，分別做好標(biāo)記；

（6）細(xì)胞離心：在室溫條件下，將細(xì)胞于1000rpm離心5min；

（7）細(xì)胞重懸：離心后，在生物安全柜內(nèi)小心倒去上清，吸取2 mL新鮮完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞至單細(xì)胞懸液；

（8）細(xì)胞計(jì)數(shù)：取少量單細(xì)胞懸液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，吸取染色后的液體加入計(jì)數(shù)板，用CELLImage Mini全自動(dòng)活細(xì)胞成像儀拍照，隨后在Readcells分析端對(duì)其計(jì)數(shù)分析；

（9）二次離心：細(xì)胞放置于離心機(jī)1000rpm離心5min；

（10）凍存液重懸：離心后，在生物安全柜內(nèi)小心倒去上清，吸取2 mL凍存液重懸細(xì)胞至單細(xì)胞懸液；

（11）凍存細(xì)胞：將細(xì)胞懸液吹打混勻后，均勻加入凍存管中，在對(duì)應(yīng)凍存管壁標(biāo)記好細(xì)胞名稱，凍存日期，細(xì)胞代數(shù)等信息；

（12）程序降溫：將細(xì)胞放入程序降溫盒，放置于-80℃冰箱程序降溫，次日轉(zhuǎn)移凍存細(xì)胞至液氮儲(chǔ)存。

實(shí)驗(yàn)總結(jié)：

CELLImage Mini全自動(dòng)活細(xì)胞成像儀不僅能夠動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)全程的生長(zhǎng)變化信息，揭示細(xì)胞殺傷、分裂、遷移等生命活動(dòng)的細(xì)微變化過(guò)程，記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中關(guān)鍵信息，實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)研究調(diào)控物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的影響；而且支持紅綠藍(lán)三通道熒光拍攝，對(duì)于一些穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建、監(jiān)測(cè)細(xì)胞熒光表達(dá)、凋亡監(jiān)測(cè)、熒光染料染色實(shí)驗(yàn)幫助極大。活細(xì)胞動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)技術(shù)實(shí)驗(yàn)全程不耗費(fèi)人力，所有細(xì)胞圖像的拍攝記錄都可以由設(shè)備獨(dú)立完成，實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)，高通量，長(zhǎng)期穩(wěn)定性和低干擾的結(jié)合。